Entwicklung einer PCR-basierten Methode zur Detektion von Mykoplasmenkontaminationen in Zellkulturen und Vergleich mit etablierten Nachweismethoden

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Projektbetreuer: Frau Fischer, Frau Blissenbach
Projektteam: Luisa Buhleier, Julia Diether, Dominic Heinrich, Lukas Moos
Projekt-Phase: August 2019 - Januar 2020




Kurzfassung: Diese Projektarbeit beschäftigt sich mit dem Vergleich und der Validierung verschiedener Nachweismethoden für Mykoplasmen mittels PCR. Dafür wurden ein bereits etabliertes Kit und ein selbst zusammengestellter PCR-Ansatz benutzt. Das Verfahren basiert auf der Detektion von Mykoplasmen-DNA im Zellkulturmedium, beziehungsweise in den Zellen selbst. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien mit Mykoplasmen gezielt infiziert, um diese miteinander zu vergleichen. Ein Teil des Mediums wurde entnommen und einer DNA-Extraktion unterzogen. Es folgten bereits erwähnte PCR-Läufe. Anschließend wurden die Produkte in Agarosegelen aufgetrennt. Für die Visualisierung wurde eine Färbung der Gele durchgeführt mit einem Fluorometer dargestellt. Außerdem wurden am letzten Versuchstag die infizierten Kulturen durch eine Fluoreszenzfärbung überprüft. Nach dem Austausch der Polymerase gegen die optimierte Polymerase des Kit-Herstellers konnten die Kontrollen eindeutig nachgewiesen werden. Ein Nachweis der Mykoplasmen-DNA mittels PCR gelang zum jetzigen Zeitpunkt nicht. Durch die DNA-Färbung mittels Fluoreszenzfarbstoff konnte allerdings ein Mykoplasmennachweis erbracht werden.
Abstract: This project work deals with the topic of comparing and validating different detection methods for mycoplasma using PCR. For the detection of mycoplasma an already established kit and a self-assembled PCR have been used. This procedure is based on detection of mycoplasma DNA in cell culture media or in cells themselves. Two different cell lines were specifically infected with mycoplasma for comparison. A part of the media was removed and subjected to an extraction of DNA. This was followed by already mentioned PCR-expermients. Hereafter the products were separated in agarose gels. For visualization, these gels have been stained and displayed for analysis with a fluorometer. Furthermore, the infected cultures were checked for mycoplasma contamination by fluorescent staining on the last day of the experiment. After replacing the polymerase with the optimized polymerase from the kit manufacturer, the controls could be clearly demonstrated. The detection of mycoplasma DNA using PCR has not been possible by now. The staining of DNA by fluorescent dye clearly proofed the presence of mycoplasma in the infected cultures.
   

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